近日，浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖遺傳科董旻岳主任團隊和真邁生物合作，在Nature 子刊Laboratory Investigation （JCR Q1 醫(yī)學：研究與實驗）在線發(fā)表題為“Non-invasive Prenatal Screening for Common Fetal Aneuploidies by Single Molecular Sequencing”的研究成果，該論文基于真邁生物GenoCare 1600單分子基因測序儀開展了477例孕婦樣本的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查NIPS，T13，T18，T21的敏感性均為100%，整體特異性也接近100%。
背景介紹
無創(chuàng)產(chǎn)前篩查Non-invasive Prenatal Screening (NIPS)，是基于孕婦外周血對胎兒染色體非整倍性進行篩查的一種方式，主要用于T13、T18和T21的檢測。目前最常用的技術手段是NGS測序。單分子測序不使用PCR，理論上可以去除PCR引入的GC偏向。在本研究中，我們對比了NGS測序平臺NextSeq 550和單分子測序平臺GenoCare 1600在NIPS的測序性能。
結果概要
圖1 入組孕婦的孕周分布圖
477名孕婦的孕周分布為12周-25周+6，峰值在19-20周。195例為高齡孕婦（>35歲），占比40.9%（圖1），T21，T18和T13的陽性例數(shù)為107，30和6例。
GenoCare 1600在NIPS的整體表現(xiàn)
測序數(shù)據(jù)過濾后，平均每例樣本獲得5.3±1.1 M unique reads，平均讀長為36.3±1.4 nt。梯度截取不同的數(shù)據(jù)量(1.5 M，2.0 M，2.5 M，3.0 M和3.5 M以上reads)，以探究檢測結果所需的最少reads數(shù)目，結果發(fā)現(xiàn)（圖2）：
1.?僅需2 M reads，T13和T18的敏感度（sensitivity）即可達到100%，而T21需要3.5M以上reads才能達到；
2.?整體特異性（specificity），隨著數(shù)據(jù)量的增加而增加，在3.5M時，達到最大值97.31%；
3.?2 M reads時，整體的陰性預測值（NPV）和T21的陽性預測值（PPV），均接近100%；
4.?數(shù)據(jù)量大于3.5M時，T18和T13的陽性預測值（PPV），達到峰值，分別為99.07%和46.15%。
圖2 不同測序數(shù)據(jù)量下的T13，T18，T21的檢測結果
5.?基于Z值的結果和羊水穿刺后胎兒染色體核型結果，T13和T21分別有6例和1例假陽性檢測結果（圖3）。
圖3 染色體13，18和21的Z score分布
6.?基于227例男胎評估胎兒濃度的檢測限，發(fā)現(xiàn)正常孕婦的胎兒濃度低于3%，而T21和T18的最低胎兒濃度是3.47%和4.31%（圖4）。
圖4 單分子測序NIPS的胎兒濃度分布
GenoCare 1600與NextSeq 550在NIPS的測序性能對比部分樣本（對照n=22，T21 n=6， T18 n=2， T13 n=1）同時采用NextSeq 550做NIPS檢測，計算Z值和GC偏向性ΔRGC2。結果顯示（圖5）：
1.?單分子測序T21，T18的Z值分布分別為6.44–12.52，9.46–24.77，而NGS測序T21，T18的Z值分布分別為3.47–7.52和6.65–21.20，單分子測序與對照界限的區(qū)分更加明顯。
2.?單分子測序的GC偏向性ΔRGC2顯著低于NGS測序(P<0.001)。
圖5 單分子測序與NGS測序性能對比（a）Z?score分布?（b）GC偏向性比較
討論與結論
1、GenoCare 1600與NextSeq 550測序儀相比，操作更為簡便，手工操作2小時，全流程一天內完成；
2、相對于NGS測序，單分子測序無需PCR，GC偏向性更低，實驗操作更少，對實驗室空間要求更低；
3、檢索近3年全球基于NGS測序的大人群隊列NIPS的研究文獻，發(fā)現(xiàn)T13，T18和T21的陽性預測值分布0-84.4%，54.84-91.2%，和79.23-100%，單分子測序的表現(xiàn)更好；
結 論
因全流程無PCR引入GC偏向，單分子測序儀GenoCare 1600可全方面提升NIPS性能，而其簡單的文庫構建方式，可以縮短項目交付周期和降低檢測成本，今后更多樣本的檢測數(shù)據(jù)會有助于繼續(xù)提升分析算法的準確性。