近日，真邁生物在Genomics, Proteomics & Bioinformatics（IF11.5,Genetics?&?Heredity JCR Q1）上發(fā)表了題為“A Two-color Single-molecule Sequencing Platform and Its Clinical Applications”的研究成果。該研究介紹了真邁生物GenoCare 1600系列單分子基因測序平臺的雙色熒光測序化學(xué)原理，并完成了大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)樣品測序，下機(jī)數(shù)據(jù)一致序列的準(zhǔn)確率達(dá)到99.99%。研究者還評估了GenoCare 1600在微生物混合物和新冠患者咽拭子樣本上的檢測性能。研究結(jié)果表明：GenoCare 1600可以完成微生物的定量，靈敏地識別新冠狀病毒，并能準(zhǔn)確檢測病毒的突變位點（通過Sanger測序驗證），以上性能顯示了其優(yōu)秀的臨床應(yīng)用潛力。
過去二十年，DNA測序技術(shù)已成為科研和診斷領(lǐng)域的關(guān)鍵工具。人類基因組計劃的完成，高通量測序技術(shù)（next-generation sequencing, NGS）取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，尤其是基于邊合成邊測序（sequencing-by-synthesis）的技術(shù)。與此同時，單分子測序技術(shù)（Single-molecule sequencing）也取得顯著突破，如：Pacific Biosciences采用零模波導(dǎo)檢測單個DNA聚合酶延伸發(fā)出熒光信號的single-molecule real-time、Oxford Nanopore Technologies的納米孔測序技術(shù)。雖然這兩種測序技術(shù)產(chǎn)生的reads更長（>10 Kb），但因測序通量低（單個run下機(jī)reads數(shù)少）、試劑成本高以及實驗繁瑣等因素大大限制其在臨床上的應(yīng)用。
01??單分子雙色測序化學(xué)實驗流程與性能
經(jīng)過72 cycles，雙色反應(yīng)系統(tǒng)的read長度就達(dá)到約41 nt，比單色反應(yīng)系統(tǒng)120 cycles的read長了2 nt，均能產(chǎn)出10 M reads，而且整體錯誤率比單色更低。實驗操作方面，文庫構(gòu)建步驟少，時間短，DNA文庫1.5 h (圖1A)，RNA文庫2.8 h (圖1B)。
簡單基因組（phi X174 噬菌體）測序，24 h獲得了334.3 M reads，平均每條lane的數(shù)據(jù)量為20.9 M unique reads，變異系數(shù)為4.5%。模式物種大腸桿菌，全基因測序需要15 h，豐度最高的reads為70 nt，平均測序讀長53 nt（圖2A）。平均每條lane的數(shù)據(jù)量為12.2 M，僅有0.61%的mismatch，1.45%的插入錯誤，2.76%的缺失錯誤。整體測序深度為130×（圖2B），基因組覆蓋率為99.94%，一致序列準(zhǔn)確度為99.99%。為了模擬臨床樣本的病原微生物檢測，研究者混合了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、M13噬菌體、釀酒酵母以及人源DNA，并將GenoCare 1600的測序結(jié)果與高通量測序平臺Hiseq 4000與qPCR得到的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示：GenoCare 1600檢測M13噬菌體含量在10－6到10－3時與理論濃度一致，優(yōu)于qPCR。
圖2 大腸桿菌基因組樣本的單分子測序結(jié)果
既然，GenoCare?1600在檢測單一噬菌體、細(xì)菌以及混合的微生物樣本方面都表現(xiàn)出優(yōu)異性能，那么，該平臺能用于新冠病毒的溯源研究嗎？研究人員采集了3例新冠陽性患者和一名健康志愿者的咽拭子。對于陽性樣本，GenoCare 1600測序得到的超過5萬條reads可以比對到新冠病毒的基因組，覆蓋了整個基因組99.9%的區(qū)域。此外，檢測得到的突變位點，均經(jīng)過Sanger測序方法進(jìn)行了驗證，其中位于ORF8（location 28144）的T-C突變被確認(rèn)為當(dāng)時流行的新冠病毒株特有突變位點。
1.?雙色測序化學(xué)提升了單分子測序的效率，相對于單色，cycle數(shù)更少，read更長；
2.?GenoCare 1600測序平臺可以快速并準(zhǔn)確檢測病原細(xì)菌和RNA病毒；
3.?GenoCare 1600測序平臺可以準(zhǔn)確檢測新冠病毒的突變位點；
4.?單分子測序平臺操作簡便，對于缺少NGS測序經(jīng)驗的臨床機(jī)構(gòu)更為友好。
Chen F, Liu B, Chen M, et al. A Two-color Single-molecule Sequencing Platform and Its Clinical Applications[J]. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2024: qzae006.