近日，中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院王金凱教授課題組在Molecular Cell(IF 14.5)上發(fā)表了題為“Spatial control of m6A deposition on enhancer and promoter RNAs through co-acetylation of METTL3 and H3K27 on chromatin”的研究成果。通過全基因組CRISPR/Cas9篩選發(fā)現(xiàn)，H3K27ac的乙?；竝300介導(dǎo)的METTL3乙酰化抑制METTL3與METTL14的結(jié)合，進而抑制了METTL3在H3K27ac染色質(zhì)上的定位，從而抑制H3K27ac染色質(zhì)區(qū)域產(chǎn)生的增強子RNA(eRNA，enhancer?RNA)和啟動子相關(guān)非編碼RNA(paRNA，promoter?associated RNA)的m6A修飾。這種乙?；饕l(fā)生在H3K27ac染色質(zhì)上。而METTL3-3KR乙?；Щ钚屯蛔兇龠M了eRNA和paRNA的m6A修飾，這導(dǎo)致鐵死亡抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄被抑制。此外，PAK2通過磷酸化METTL3促進p300對METTL3的乙?；?，因此抑制PAK2使得METTL3乙?；抡{(diào)，進而促進鐵死亡。本研究揭示了m6A修飾在eRNA和paRNA上的空間選擇性調(diào)控機制，為理解m6A在基因表達調(diào)控中的作用提供了新的見解。真邁生物SURFSeq 5000平臺為本研究中的GLORI-seq和CUT&Tag測序提供了高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。
m6A是一種在哺乳動物細胞中豐富的RNA修飾，由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體(MTC)催化，其中METTL3/METTL14異二聚體是MTC的催化亞基。研究表明，m6A甲基化通過調(diào)控RNA的轉(zhuǎn)錄生成、剪接、穩(wěn)定性及翻譯在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。而m6A已經(jīng)被揭示與多種組蛋白修飾(如H3K36me3、H3K9me3、H3K27me3、H3K27ac等）之間存在關(guān)聯(lián)。MTC可以富集在H3K27ac染色質(zhì)上促進eRNA和paRNA的m6A修飾，進而影響基因轉(zhuǎn)錄。然而，目前尚不清楚該過程是如何被調(diào)控的。此外，MTC的催化亞基METTL3/METTL14異二聚體的解聚是如何被調(diào)控的也不清楚，這一過程是否可以參與eRNA和paRNA的m6A修飾特異性調(diào)控呢？
研究者通過全基因組CRISPR/Cas9篩選聯(lián)合TETon-BIFC報告系統(tǒng)在A549細胞中系統(tǒng)性鑒定出一系列METTL3/METTL14異二聚體解聚的調(diào)控因子。進一步，通過免疫共沉淀、3D-SIM、高通量質(zhì)譜等技術(shù)闡明了METTL3在H3K27ac染色質(zhì)的定位依賴于其與METTL14的結(jié)合，而乙?；竝300通過介導(dǎo)METTL3的K177、K215、K578氨基酸位點發(fā)生乙?；揎棧M而抑制METTL3與METTL14的結(jié)合，使得METTL3不能定位于H3K27ac染色質(zhì)。PAK2通過磷酸化METTL3的S243氨基酸位點，促進了p300介導(dǎo)的METTL3乙?；瑥亩鴧⑴c該調(diào)控過程。并且，研究者還采用了真邁生物SURFSeq 5000平臺完成了野生型METTL3及METTL3-3KR突變（模擬去乙?；┑腁549細胞的CUT&Tag測序?qū)嶒灒诨蚪M水平驗證了METTL3的乙?；瘜τ谄湓贖3K27ac染色質(zhì)定位的抑制作用。
圖1 METTL3/METTL14異源二聚體調(diào)控因子的篩選
研究者接下來探究了METTL3在H3K27ac染色質(zhì)上的定位是否調(diào)控H3K27ac染色質(zhì)相關(guān)RNA(caRNA)的m6A修飾。利用真邁生物的SURFSeq 5000平臺完成了METTL3野生型、METTL3-3KR突變型A549細胞的染色質(zhì)RNA的GLORI-seq,實驗結(jié)果表明：相對于H3K36me3和H3K9me3標(biāo)記的常染色質(zhì)和異染色質(zhì)區(qū)域，METTL3-3KR突變更為顯著上調(diào)H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K27ac、p300標(biāo)記的活性增強子和啟動子區(qū)域的m6A修飾，這主要導(dǎo)致了eRNA和paRNA上的m6A上調(diào)，并降低其穩(wěn)定性，進而導(dǎo)致其相關(guān)mRNA水平下調(diào)。
圖2?METTL3乙酰化抑制eRNA和paRNA的m6A修飾從而促進下游基因表達
進一步，研究者發(fā)現(xiàn)這些m6A修飾上調(diào)的eRNA和paRNA的關(guān)聯(lián)基因顯著富集于鐵死亡調(diào)控相關(guān)通路，如：氧化還原酶活性、不飽和脂肪酸代謝過程、類固醇代謝過程和NRF2通路。因此，METTL3-3KR突變導(dǎo)致這些鐵死亡抑制基因的表達下調(diào)，進而促進鐵死亡誘導(dǎo)劑引起的細胞死亡和脂質(zhì)過氧化。此外，PAK2抑制劑也能夠通過METTL3乙?；蕾嚨姆绞酱龠M鐵死亡誘導(dǎo)劑引起的細胞死亡。最后，研究者通過TCGA數(shù)據(jù)揭示了PAK2在METTL3高表達的肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中影響患者的預(yù)后。
圖3?METTL3乙?；种芿RNA和paRNA的m6A修飾從而抑制鐵死亡
1、H3K27ac的乙酰化酶p300介導(dǎo)的METTL3乙?；种芃ETTL3與METTL14的結(jié)合；
2、PAK2通過磷酸化METTL3，促進p300介導(dǎo)的METTL3乙?；?；
3、METTL3的乙?；种破湓贖3K27ac染色質(zhì)上的定位，從而抑制eRNA和paRNA的m6A修飾；
4、METTL3乙?；种芿RNA和paRNA的m6A修飾，進而抑制鐵死亡抑制基因的表達以促進鐵死亡。
Huang X,?Zhang J,?Cun YX,?et al.Spatial control of?m6A?deposition on enhancer and promoter RNAs through co-acetylation of METTL3 and H3K27 on chromatin[J].Molecular Cell,?2025,DOI:?10.1016/j.molcel.2025.02.016
GLORI(Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine)乙二醛和亞硝酸鹽介導(dǎo)的非甲基化腺苷（A）脫氨基測序技術(shù)是針對m6A修飾開發(fā)的單堿基檢測技術(shù)。實現(xiàn)了真正意義的高效率、高靈敏度、高特異性、無偏好單堿基m6A位點檢測，并對m6A位點的修飾水平進行絕對定量，也是RNA的m6A檢測的主流NGS手段。其技術(shù)原理如下圖所示：
GLORI-seq技術(shù)原理圖
了解更多GLORI-seq技術(shù)原理，請訪問：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01487-9
首先提取總RNA，進行片段化，片段化的產(chǎn)物經(jīng)過乙二醛和亞硝酸鹽處理，RNA在乙二醛和亞硝酸鹽的催化體系來有效地將未甲基化的腺苷（Adenosine)脫氨基轉(zhuǎn)換成形成肌苷（Inosine,I），肌苷I在逆轉(zhuǎn)錄過程中與胞苷(Cytidine）配對，在測序過程中被讀作鳥苷（Guanosine），但m6A保持不變，測序后仍讀為A。因此，GLORI通過檢測測序序列中A的比例實現(xiàn)了單堿基分辨。
SURFSeq 5000平臺在GLORI測序方面，表現(xiàn)優(yōu)異，數(shù)據(jù)得率高，目前已有2篇Molecular Cell的文章發(fā)表，證實了SURFSeq 5000在m6A測序中的明顯優(yōu)勢。
撰稿：科研合作部 劉永鋒
審核：王金凱教授團隊
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