近日，由中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“中信湘雅”）林戈課題組和深圳市真邁生物科技有限公司（以下簡(jiǎn)稱“真邁生物”）聯(lián)合組成的研究團(tuán)隊(duì)在預(yù)印本服務(wù)網(wǎng)站BioRxiv在線發(fā)表了題為Accurate CNV identification from only a few cells with low GC bias in a single-molecule sequencing platform的學(xué)術(shù)論文。
論文結(jié)果展示，團(tuán)隊(duì)合作研發(fā)的基于GenoCare單分子測(cè)序儀的微量細(xì)胞檢測(cè)方案在檢測(cè)靈敏度和時(shí)間上優(yōu)于傳統(tǒng)NGS（Next generation sequencing）檢測(cè)方法，這是我國(guó)自主開發(fā)的單分子測(cè)序平臺(tái)首次應(yīng)用于單細(xì)胞及微量細(xì)胞研究領(lǐng)域的案例，研究成果將進(jìn)一步推動(dòng)國(guó)產(chǎn)基因測(cè)序平臺(tái)在未來(lái)臨床研究和應(yīng)用中的廣泛普及。
在基于微量細(xì)胞進(jìn)行拷貝數(shù)異常（CNV，Copy number variation）分析的科研及臨床診斷的多種應(yīng)用中，NGS（Next generation sequencing）相比于傳統(tǒng)的FISH（Fluorescence in situ hybridization）、aCGH（Array comparative genomic hybridization）芯片檢測(cè)等技術(shù)具有更高的檢測(cè)分辨率和更大的發(fā)展?jié)摿Α１M管已有的NGS技術(shù)在這一領(lǐng)域的應(yīng)用已較為成熟，但仍有改進(jìn)和提升的空間。
首先，由于獲取的樣本細(xì)胞數(shù)極少，受限于二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)建庫(kù)起始量的要求，必須在建庫(kù)前對(duì)樣本進(jìn)行全基因組擴(kuò)增（Whole Genome Amplification, WGA）。盡管WGA技術(shù)在不斷發(fā)展，其擴(kuò)增過(guò)程中引入的偏差仍會(huì)或多或少地影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性和靈敏度；其次，現(xiàn)有檢測(cè)方法建庫(kù)流程較為復(fù)雜，導(dǎo)致整體檢測(cè)周期較長(zhǎng)，一般來(lái)說(shuō)從樣本制備到獲得最終的檢測(cè)結(jié)果至少需要2天的時(shí)間?，F(xiàn)有技術(shù)的普及還受到成本較高的限制。
基于這些亟待解決的問(wèn)題，中信湘雅聯(lián)合真邁生物共同研發(fā)出了一套基于單分子測(cè)序技術(shù)的微量細(xì)胞CNV檢測(cè)體系，在保持檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度的同時(shí)提升染色體異常檢測(cè)的靈敏度，大大降低檢測(cè)過(guò)程的復(fù)雜度以及檢測(cè)成本。該研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于細(xì)胞直接裂解結(jié)合Tn5轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)的建庫(kù)方法，可以跳過(guò)傳統(tǒng)意義上的WGA步驟直接進(jìn)行建庫(kù)，采用該方法可對(duì)低至5個(gè)細(xì)胞進(jìn)行直接裂解建庫(kù)，并成功在單分子基因測(cè)序儀GenoCare 1600上完成了測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。研究結(jié)果表明，相比于基于WGA的建庫(kù)方法，該建庫(kù)方法具有明顯更低的GC偏好（圖1）。
圖1 基于不同建庫(kù)方法的GC 偏好對(duì)比
為了驗(yàn)證該體系的染色體異常檢測(cè)能力，該研究對(duì)6種帶有不同染色體微小結(jié)構(gòu)變異的細(xì)胞系進(jìn)行了檢測(cè)（其中最小的染色體結(jié)構(gòu)異常為1.29M的一段染色體缺失），并將單分子測(cè)序系統(tǒng)的分析結(jié)果與二代測(cè)序平臺(tái)Illumina HiSeq X Ten的結(jié)果進(jìn)行了一致性分析。研究結(jié)果表明，該檢測(cè)體系的分析結(jié)果與基于二代測(cè)序平臺(tái)的分析結(jié)果完全一致，對(duì)低至1.29M的染色體結(jié)構(gòu)異?？蓽?zhǔn)確檢出（圖2）。
圖2? 基于GenoCare 1600與HiSeq X Ten的CNV測(cè)序結(jié)果對(duì)比（染色體異常：46, XX, del(1p36.33-1p36.32) 1.29M）
在基于微量細(xì)胞為研究樣品的不同應(yīng)用場(chǎng)景中，嵌合一直是困擾科研人員的一個(gè)重要因素。如在植入前胚胎中，染色體非整倍體嵌合情況較為常見。而不同類型和比例的嵌合對(duì)臨床結(jié)局有一定影響。因此，對(duì)于少量細(xì)胞的染色體非整倍體嵌合狀況進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)顯得尤為重要。根據(jù)國(guó)際植入前遺傳學(xué)診斷學(xué)會(huì)PGDIS（Preimplantation Genetic Diagnosis International Society）的建議，高于80%的異常嵌合建議按非整倍體處理，低于20%的異常嵌合建議按整倍體處理，介于20~80%之間的異常嵌合可作為臨床醫(yī)生的參考，根據(jù)具體情況來(lái)選擇處理方案。該研究團(tuán)隊(duì)同時(shí)對(duì)該檢測(cè)體系的嵌合異常胚胎的檢出效力進(jìn)行了評(píng)估，將正常細(xì)胞系gDNA與染色體異常細(xì)胞系gDNA按0%~100%的不同比例進(jìn)行混合模擬不同的嵌合比率進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序檢測(cè)分析。結(jié)果表明，該檢測(cè)體系可對(duì)低至20%的異常嵌合成功檢出（圖3）。
圖3 基于GenoCare 1600的微量細(xì)胞系CNVs檢測(cè)結(jié)果
（染色體異常：46, XY, dup(2p25.3-2p16.2) 53.26M，20%嵌合）
?論文第一作者、中信湘雅胡亮博士表示，中信湘雅一直致力于與國(guó)內(nèi)同道共同推進(jìn)植入前遺傳領(lǐng)域新技術(shù)的研發(fā)、應(yīng)用和推廣。與現(xiàn)有檢測(cè)方法比較，本次基于Tn5轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)建庫(kù)并利用GenoCare單分子測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行CNV檢測(cè)，在保持高準(zhǔn)確度的同時(shí)，盡量減少了WGA引起的GC偏好性。另外，該策略的檢測(cè)流程也比較簡(jiǎn)單。
論文共同通訊作者、真邁生物醫(yī)學(xué)研發(fā)總監(jiān)張萌表示，作為一種新的平臺(tái)方案，基于單分子測(cè)序的微量細(xì)胞檢測(cè)在靈敏度、時(shí)間和成本上都具有明顯的優(yōu)勢(shì)。期待這種新的方法能為科研工作者的研究提供一種新的思路，我們也會(huì)通過(guò)不斷的測(cè)試和完善去推動(dòng)它早日作為一種篩查診斷方案應(yīng)用至臨床，造福更多的普通人。
據(jù)悉，中信湘雅與真邁生物將進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，適時(shí)開展相關(guān)基礎(chǔ)及臨床研究，以充分驗(yàn)證和推動(dòng)單分子基因測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用。
關(guān)于中信湘雅
中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院（原中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院不孕與遺傳?？漆t(yī)院）是現(xiàn)代化大型生殖與遺傳專科醫(yī)院，前身是中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院人類生殖工程研究室門診部。
自1980年在我國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)奠基人盧惠霖教授的指導(dǎo)下，盧光琇教授在國(guó)內(nèi)開展人類輔助生殖技術(shù)研究和臨床工作以來(lái)，先后于1988年被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為國(guó)家精子庫(kù)技術(shù)指導(dǎo)中心，2007年成為衛(wèi)生部公布的人類輔助生殖技術(shù)和人類精子庫(kù)技術(shù)培訓(xùn)基地，2017年成為國(guó)家基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用示范中心（湖南孕前診斷分中心）。
醫(yī)院歷經(jīng)30余年的探索和實(shí)踐，現(xiàn)已經(jīng)發(fā)展成為經(jīng)衛(wèi)生部審查批準(zhǔn)，擁有湖南地區(qū)合格人類冷凍精子庫(kù)的三級(jí)生殖與遺傳專科醫(yī)院。2017年獲全國(guó)衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)先進(jìn)集體榮譽(yù)稱號(hào)，同年獲湖南省創(chuàng)新獎(jiǎng)。
關(guān)于真邁?
真邁生物（GeneMind Biosciences）創(chuàng)立于2012年，總部現(xiàn)設(shè)于深圳羅湖，擁有辦公、研發(fā)和生產(chǎn)場(chǎng)地共8000余平米。真邁生物專注于基因測(cè)序產(chǎn)業(yè)上游設(shè)備和試劑的研發(fā)制造，以自主開發(fā)的第三代單分子基因測(cè)序儀為核心，具備從原料、試劑到設(shè)備、軟件的全流程解決方案，是國(guó)際上屈指可數(shù)的擁有自主基因測(cè)序儀品牌的硬科技企業(yè)。
真邁全職團(tuán)隊(duì)共100余人，其中經(jīng)政府認(rèn)定的“高層次人才”占25%以上，海內(nèi)外研究生學(xué)歷50%以上。公司擁有180余項(xiàng)國(guó)內(nèi)外專利授權(quán)和申請(qǐng)（包括中國(guó)、美國(guó)、歐洲等地區(qū)），17項(xiàng)計(jì)算機(jī)軟件著作權(quán)，覆蓋基因測(cè)序平臺(tái)的“儀器-試劑-芯片-算法-應(yīng)用”全流程模塊。
真邁生物擁有自主開發(fā)的國(guó)產(chǎn)單分子基因測(cè)序儀GenoCare及配套試劑盒，可無(wú)需擴(kuò)增直接檢測(cè)DNA信息。目前，GenoCare已通過(guò)醫(yī)療器械注冊(cè)檢驗(yàn)，單分子測(cè)序通用試劑盒已獲得第一類醫(yī)療器械備案資質(zhì)。同時(shí)，GenoCare單分子基因測(cè)序儀等5項(xiàng)產(chǎn)品已獲得歐盟CE標(biāo)志，是首個(gè)獲得歐盟CE標(biāo)志的國(guó)產(chǎn)第三代基因測(cè)序儀產(chǎn)品。