中藥資源是中藥產業(yè)發(fā)展的基礎，中藥資源研究方法正逐步形成以分子生物學、生物信息學及計算機科學等為主要研究手段的多學科交叉體系。眾所周知，中藥方劑化學成分復雜，難以找到單一作用靶點，闡明可能的藥理，而轉錄組學可以對藥物干預機體的分子變化進行多維度、多靶點的描繪，以彌補單基因研究的不足，全面揭示藥理機制，從而為方藥有效成分的篩選、新藥的發(fā)現(xiàn)以及優(yōu)良種質資源的培育奠定基礎，為中西醫(yī)結合治療提供數(shù)據(jù)支撐。

近日，真邁生物的合作單位紹興市婦幼保健院在《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》雜志上發(fā)表了題為“Inhibition of Hepatitis B Virus (HBV) replication and antigen expression byBrucea javanica(L.) Merr. oil emulsion”的研究成果。該研究結合分子生物學實驗及高通量測序證實：鴉膽子（Brucea javanica(L.) Merr.）油乳劑（BJOE）對人乙型肝炎病毒（HBV）的復制和抗原表達存在明顯的抑制作用，且這種作用是通過上調白細胞介素6（IL-6）實現(xiàn)的，揭示了其潛在的抗病毒機理。基于真邁生物GenoLab M高通量基因測序平臺對BJOE處理前后的肝癌細胞系HepG2進行轉錄組測序，進一步確定BJOE對肝癌細胞中IL-6基因的影響。本研究為BJOE的HBV臨床治療潛力提供了新的見解，也說明對于真實樣本的轉錄組測序，GenoLab M表現(xiàn)依然優(yōu)秀，獲得學術界的認可。

*以下為該研究成果解讀

背景簡介

乙型肝炎病毒（HBV) 感染是目前全球最主要的健康衛(wèi)生問題之一，慢性HBV感染是導致肝硬化、肝衰竭及肝細胞癌發(fā)生的重要原因。據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計：2019年，全球有2.96億人患有慢性乙肝感染，且每年有150萬新發(fā)感染者，對公共安全造成很大威脅。HBV是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，包括三種重要的免疫標記物，也是HBV病毒組裝的三個重要組成成分：HBsAg（乙肝表面抗原），HBeAg（乙肝e抗原），HBcAg（乙肝核心抗原）。目前，抗HBV治療藥物主要有兩類：α干擾素（IFN-α）和核苷類似物NAs（如lamivudine：中文名拉米夫定，簡稱LMV）。前者通過直接抗病毒、免疫調節(jié)和抗增殖作用發(fā)揮抗病毒活性；后者通過模擬生理核苷，靶向HBV逆轉錄酶，有效抑制病毒DNA復制。但是，由于耐藥突變的不斷出現(xiàn)、病毒載量的提高及血清中轉氨酶的增加，會導致抗HBV藥物的療效顯著降低。因此，HBV治療仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。

鴉膽子是盛產于我國南方的一種中藥材，味苦、性寒、微毒，被報道對多種疾病具有良好的治療效果，包括癌癥、瘧疾、痢疾及胃潰瘍等。鴉膽子種子提取的重要成分，具有顯著的抗植物病毒活性。然而，鴉膽子是否能抗HBV，如能，這種抗性的機制又是怎樣的呢？目前尚無報道。本文通過大量的體外實驗，研究鴉膽子油乳劑對HBV體外復制、抗原表達及細胞因子分泌的作用，證實其對乙型肝炎的臨床治療潛力，并闡明其可能的抗病毒作用機制。

結果概要

01?研究框架

本研究使用三種肝癌細胞系：Huh7，HepG2以及HepG2.2.15（由HepG2改造而來，可以穩(wěn)定表達HBV亞復制子和病毒抗原），Huh7和HepG2體外轉染HBV-WT（野生型）或HBV-LMV-MT（抗拉米夫定突變型）復制子質粒以實現(xiàn)HBV的穩(wěn)定復制和抗原表達。使用不同劑量的BJOE處理細胞，通過細胞活性檢測、qRT-PCR（實時熒光定量PCR）、CMIA（化學發(fā)光微粒子免疫測定）、Western Blot（蛋白免疫印跡）、FCM（流式細胞術）以及RNA-seq（轉錄組測序）等技術手段，確定BJOE的抗HBV作用機制。

02?BJOE對細胞活力的影響

該研究首先檢測在不同的劑量濃度和時間梯度下，BJOE對肝癌細胞活力的影響，以確定合適的BJOE使用濃度，用于后續(xù)抗病毒實驗，以避免BJOE對細胞產生毒性作用。通過CCK-8實驗（細胞增殖和細胞毒性檢測）證實（Figure 1E-G）：BJOE≤5 mg/ml，作用時間24小時和48小時，均不會造成肝癌細胞活力的明顯改變，故后續(xù)研究中BJOE使用的最大濃度為5 mg/ml。

隨后，研究人員使用BJOE處理HepG2.215，以及轉染HBV-WT的HepG2和Huh7細胞。通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與拉米夫定抑制病毒復制的結果類似，BJOE可以有效降低HBV的復制水平，尤其在5 mg/ml使用濃度時，約40%的HBV復制被抑制（Figure 2A-C）。CMIA檢測細胞上清中HBsAg和HBeAg，Western Blot檢測HBcAg表達水平，結果表明：三種乙肝病毒抗原在BJOE處理后，都呈現(xiàn)明顯的下調，而拉米夫定對HBV抗原表達沒有影響（Figure 2D-H）。

通過FCM檢測BJOE處理后肝癌細胞上清中細胞因子的水平，發(fā)現(xiàn)BJOE顯著增強HepG2和Huh7細胞中IL-6的分泌，但在HepG2.215細胞中，作用并不明顯（Figure 3）。為進一步驗證BJOE、IL-6和HBV的關系，對轉染HBV-WT質粒的HepG2和Huh7細胞分別使用BJOE和DMSO（二甲基亞砜）處理，檢測上清中細胞因子的水平，結果表明：DMSO顯著下調IL-6的水平，與其促進病毒復制的作用一致；而BJOE顯著上調IL-6的水平，結合上述BJOE抑制HBV復制和抗原表達的結果，我們推測BJOE通過上調IL-6從而發(fā)揮抗病毒作用（Figure 4A-B）。研究人員為驗證上述推測，對HBV-WT轉染的HepG2和Huh7細胞，外源加入重組IL-6后，發(fā)現(xiàn)兩種細胞中HBV的復制及抗原表達均被明顯抑制，說明IL-6的上調可以直接抑制HBV的轉錄和復制，而這種上調是BJOE刺激引起的（Figure 4C-D）。

為進一步探討B(tài)JOE對肝癌細胞中IL-6轉錄水平的影響，研究人員對BJOE處理的HepG2細胞進行了轉錄組測序。結果表明：BJOE導致HepG2細胞中IL-6基因上調，且IL-6作為關鍵基因，在細胞內與多種基因存在相互作用。在GO富集通路中，IL-6廣泛參與肝臟相關的生物學過程，包括肝細胞增殖和形態(tài)發(fā)生，以及肝臟功能實現(xiàn)（Figure 5）。

HepG2/Huh7細胞轉染HBV-WT或HBV-LMV-MT質粒后，使用BJOE或拉米夫定處理細胞，然后通過qRT-PCR及FCM檢測HBV的復制及抗原表達。結果表明，5 mg/ml BJOE可以有效抑制WT和LMV-MT的復制，以及HBV抗原的表達；而LMV僅對WT有效，對突變型無效。當兩者聯(lián)合使用時，抗病毒效應被加強（Figure 6）。

為進一步探討鴉膽子單一成分的抗HBV作用，研究人員使用鴉膽子苦醇（brusatol）、鴉膽子堿A（bruceine A）、鴉膽子堿B（bruceine B）、鴉膽亭（bruceantin）和鴉膽子苦味素（bruceantinol）分別處理HepG2和Huh7細胞后，檢測上清中細胞因子的水平，結果表明：鴉膽子堿B可以上調IL-6的水平（Figure 7A-B），且在HepG2.215中有效抑制HBV復制和抗原表達（Figure 7C）。

基于上述分析，我們得出如下結論：

1、BJOE可以有效抑制HBV復制及病毒抗原表達；

2、BJOE可以調節(jié)IL6的分泌，進而發(fā)揮抗病毒作用；

3、BJOE不僅對WT病毒發(fā)揮有效的抗病毒作用，對LMV-MT病毒同樣有效；

4、在BJOE抗HBV作用中，其活性成分--鴉膽子堿B發(fā)揮關鍵作用。