近日，真邁生物與合作單位上海交通大學醫(yī)學院附屬第一人民醫(yī)院在Frontiers in Genetics的Genomic Assay Technology版塊上發(fā)表了題為“Systematic comparison of variant calling pipelines of target genome sequencing cross multiple next-generation sequencers”的研究成果。該研究涵蓋了兩種腫瘤panel：TSO500和TargetSeq One；三種典型樣本：FFPE，cf DNA（cell-free DNA）?和cell line；六個主流的NGS測序平臺：NovaSeq 6000，NextSeq 550，MGISEQ 2000，GenoLab M，F(xiàn)ASTASeq 300，SURFSeq 5000；五種常用的突變分析軟件：HaplotypeCaller，Mutect2，SiNVICT，SNVer和VarScan 2。

靶向基因組測序(TS)是一種有效的高通量測序(NGS)方法，重點關注與疾病發(fā)病機制或臨床相關的一組基因或靶點。它通過快速檢測基因變異，為臨床醫(yī)生提供參考，幫助他們解釋病人基因圖譜，并為實施個性化的抗癌提供建議，極大地促進了腫瘤精準化的發(fā)展。

TSO500是一個全面的靶標測序panel，涵蓋超過8種癌癥類型和523種癌癥相關基因(1.94 Mb)，用于捕獲FFPE標準品HD832，而TargetSeq One kit 用于富集Twist cf DNA。本研究中，6個乳腺癌和卵巢癌的cell line的panel數(shù)據(jù)來自于公開數(shù)據(jù)庫SRA。

TSO500靶向測序平臺與軟件間的比較

如圖1a和1b所示，NovaSeq 6000，NextSeq 550，GenoLab M和FASTASeq 300四個測序平臺在SNP和InDel檢測的靈敏度（sensitivity）方面表現(xiàn)出幾乎一致的結果，雖然SiNVICT和Mutect2在InDel的calling上有一些細微差異。FASTASeq 300測序儀基于SNVer和VarScan2軟件，可以檢出樣本中全部的SNP和InDel突變（sensitivity=100%）。對于F-score和精確度（precision），SNVer和VarScan2在SNP和InDel檢測上也表現(xiàn)最好。此外，與ddPCR驗證的真集相比，四個測序平臺一致性都比較高，特別是使用SNVer和VarScan2兩個分析工具(1c）。

Pearson相關系數(shù)(r)熱圖(圖1d)顯示，在相同的軟件下，不同測序平臺呈現(xiàn)出相似的整體性能。隨后，研究者比較了不同測序平臺與分析軟件間高置信度變異的檢測數(shù)量(圖1e)，發(fā)現(xiàn)所有數(shù)據(jù)集的一致性高達93.4%(198/212)。其中，F(xiàn)ASTASeq 300能檢測到更多的特有突變，特別是通過SNVer和VarScan2兩個軟件。

綜上，在SNP和InDel的突變檢出方面，分析軟件間比測序平臺間表現(xiàn)出的差異更大，F(xiàn)ASTASeq 300在SNVer和VarScan2軟件下表現(xiàn)更優(yōu)。

一般而言，測序深度的增加有助于變異檢測結果的重現(xiàn)和低頻突變的檢出，但需要更長的分析時間、更高的計算復雜度以及成本。研究者以突變檢出表現(xiàn)最好的FASTASeq 300測序平臺和SNVer以及VarScan2兩款軟件為研究重點，比較了不同測序深度下變異檢測時間、內(nèi)存使用、SNP和InDel檢測靈敏度的差異，期望探索到保證高靈敏度的情況下所需的最低測序深度(圖1f和1g，結果表明：至少500x的測序深度可以保證全部突變的檢出，而VarScan2軟件消耗內(nèi)存更少，運行時間更短）。

TargetSeq One捕獲的cf DNA測序平臺與分析軟件的比較

對于cf DNA樣本，軟件SNVer和VarScan2在SNP和InDel檢測方面表現(xiàn)出色。F-score, 召回率（recall）和精確度都接近100% (Fig. S2)，三個測序平臺NovaSeq 6000，MGISEQ 2000和SURFSeq 5000結果也很一致。

cell line樣本的分析軟件比較

通過下載公開數(shù)據(jù)集，研究者獲取到3個乳腺癌和3個卵巢癌的panel測序結果，并使用上述五款軟件進行突變檢測，結果表明：SNVer和VarScan2兩款軟件同樣表現(xiàn)更優(yōu)，其檢測結果最接近真集。

不同測序平臺在同一個分析軟件下，突變檢測的一致性較好。三種類型的腫瘤樣本，在突變檢測方面，SNVer和VarScan2均表現(xiàn)最優(yōu)。該項研究為腫瘤靶向測序提供了一個benchmark。該研究使用五種軟件對三種典型的腫瘤樣本進行變異檢測的性能評估，也為未來腫瘤變異研究提供了有價值的參考。

Feng B, Lai J, Fan X, et al. Systematic comparison of variant calling pipelines of target genome sequencing cross multiple next-generation sequencers[J]. Frontiers in Genetics, 2023, 14: 1293974.