第六屆中國國際進口博覽會上，羅氏診斷攜手七家國內(nèi)領(lǐng)先的NGS領(lǐng)域合作伙伴簽約共建NGS精準(zhǔn)醫(yī)療生態(tài)圈，充分整合各方優(yōu)勢和資源，共同探索和開發(fā)基于本土化需求的“樣本進，結(jié)果出”（Sample In Result Out, SIRO）全流程自動化NGS檢測方案。羅氏診斷的SIRO致力于提供NGS樣本制備的完整解決方案，搭配高效穩(wěn)定的文庫構(gòu)建和捕獲產(chǎn)品（包括HyperCap探針和HyperPETE引物延伸富集產(chǎn)品），基于羅氏診斷全自動建庫系統(tǒng)完成濕實驗流程，支持多個測序平臺開展不同檢測應(yīng)用，助力新一代測序技術(shù)（NGS）在實驗室落地。此次，羅氏診斷推出了基于真邁生物測序平臺的整體解決方案。
真邁生物目前已推出GenoCare 1600 系列單分子基因測序儀和GenoLab M 系列、FASTASeq 300系列、SURFSeq 5000系列高通量基因測序儀，形成了滿足從科研到臨床需求的低中高通量測序產(chǎn)品陣列，實現(xiàn)對應(yīng)用場景的全面覆蓋。測序儀是基因測序關(guān)鍵的一環(huán)，直接讀出堿基序列信息，為下游的分析解讀提供原始信息。今天我們一起來看看，環(huán)繞SIRO方案的精準(zhǔn)醫(yī)療生態(tài)圈建設(shè)，真邁生物測序儀與羅氏相遇，將碰撞出什么樣的火花？
基于液相雜交的SIRO方案
1.羅氏KAPA HyperExome V2外顯子SIRO方案
羅氏診斷全新升級的外顯子KAPA HyperExome V2在43.2Mb的緊湊捕獲區(qū)域內(nèi)，提供對新版本的ACMGv3.1、RefSeq、CCDS、ClinVar、Ensembl和COSMIC基因組數(shù)據(jù)庫的優(yōu)異覆蓋率，適用于醫(yī)學(xué)相關(guān)應(yīng)用。憑借超過15年的探針設(shè)計經(jīng)驗，和通過使用T2T(端粒至端粒)基因組版本進行設(shè)計優(yōu)化，HyperExome V2解決了GRCh38基因組版本中潛在的問題區(qū)域。HyperCap工作流程精簡了建庫捕獲的流程，同時高度自動化友好，提供高質(zhì)量的QC表現(xiàn)，即使在極端GC%比例的區(qū)域，也能獲得一致的覆蓋率。羅氏診斷首先評估了HyperExome V2在真邁生物測序平臺上的表現(xiàn)。整體來看，真邁測序儀數(shù)據(jù)質(zhì)量高且穩(wěn)定，捕獲相關(guān)的評估指標(biāo)達到主流水平。其中GenoLab M測序儀的數(shù)據(jù)冗余度有較明顯的降低，可以提高數(shù)據(jù)利用率；重復(fù)兩輪上機的結(jié)果重現(xiàn)性佳。SURFSeq 5000測序儀作為新機型，在均一性和測序偏好性表現(xiàn)中更勝一籌。
實驗設(shè)計：以200ng gDNA作為投入，使用KAPA HyperPlus Kit進行建庫，HyperExome V2探針進行捕獲，建庫和捕獲的全流程均在羅氏自動化建庫儀Avenio Edge System上完成。雜交終文庫，分別在GenoLab M 系列（重復(fù)兩輪上機）、SURFSeq 5000系列高通量基因測序儀和NovaSeq 6000上進行測序。分析參照羅氏白皮書——“SPR -White Paper- KAPA TE data evaluation for germline mutations”。
2.羅氏體細胞變異SIRO方案
KAPA HyperCap Oncology panel可用于快速評估體細胞變異檢測性能，靶向214Kb區(qū)域，覆蓋商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)品中最常見的基因，涵蓋體細胞腫瘤學(xué)研究相關(guān)的13個基因的完整編碼序列（ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、EGFR、ERBB2、KRAS、MET、MYCN、RAD51C、RAD51D、TP53）以及69個相關(guān)基因的熱點突變。羅氏診斷評估了KAPA HyperCap Oncology panel在真邁生物FASTASeq 300測序儀上的表現(xiàn)。下機測序數(shù)據(jù)質(zhì)量高，Raw data Q30>95%；捕獲效率、均一性和數(shù)據(jù)冗余度的表現(xiàn)佳，fold 80 base penalty可以控制在1.4以內(nèi)。將數(shù)據(jù)截取到0.3G時（FASTASeq 300單次上機可完成約24個樣本測試），去重后的有效覆蓋深度達到400X，F(xiàn)FPE標(biāo)準(zhǔn)品中的突變位點均能穩(wěn)定檢出。
實驗設(shè)計：以50ng 標(biāo)準(zhǔn)品Horizon FFPE-HD300作為投入，使用KAPA EvoPlus Kit進行建庫， HyperCap Oncology panel進行雜交。雜交終文庫，在FASTASeq 300系列高通量基因測序儀和NovaSeq 6000上進行測序。分析參照羅氏白皮書——“SPR -White Paper- KAPA TE data evaluation for somatic mutations”。
基于引物延伸法的快速測序方案
1.腫瘤cfDNA樣本體細胞變異檢測——引物延伸法
KAPA HyperPETE采用創(chuàng)新的引物延伸靶向富集技術(shù)（Primer Extension Target Enrichment，PETE），3小時完成快速高質(zhì)量富集，專為較小目標(biāo)區(qū)域（DNA<250Kb，RNA<50Kb）的靶向富集而設(shè)計，可以檢測多種突變類型：SNV、Indel、fusion(包含未知融合)、CNV和MSI。KAPA HyperPETE Pan Cancer Panel包含86個癌癥相關(guān)基因和190個MSI位點，支持FFPE和cfDNA的體細胞變異檢測應(yīng)用。羅氏診斷選用HyperPETE Pan Cancer Panel進行實驗，評估真邁生物FASTASeq 300測序儀在腫瘤低頻突變位點的檢測性能。測試結(jié)果顯示下機測序數(shù)據(jù)質(zhì)量高，Raw data Q30>95%；捕獲效率、均一性表現(xiàn)佳，fold 80 base penalty小于1.4。原始下機數(shù)據(jù)約30G，0.1%的突變位點均可檢出，當(dāng)截取數(shù)據(jù)至16.5G時（FASTASeq 300單次上機可完成約5個樣本測試），1%的突變可穩(wěn)定檢出，數(shù)個0.1%位點因支持reads少而無法穩(wěn)定檢出。測序儀的臺間差小，數(shù)據(jù)一致，表現(xiàn)穩(wěn)定。
實驗設(shè)計：以50ng cfDNA標(biāo)準(zhǔn)品Horizon-HD780作為投入，使用KAPA HyperPrep Kit進行建庫，HyperPETE Pancancer panel進行雜交。雜交終文庫，在NovaSeq 6000和兩臺FASTASeq 300系列高通量基因測序儀上進行平行測序。分析參照羅氏白皮書——“SPR -White Paper- KAPA TE data evaluation for somatic mutations”。
2.融合基因檢測——引物延申法
作為驅(qū)動癌癥產(chǎn)生的始因之一，融合基因/剪切變異的檢出深受重視。KAPA HyperPETE Lung Cancer Fusion Panel針對17個肺癌融合基因（ALK、AXL、BRAF、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、MET、NRG1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PDGFRA、PDGFRB、PPARG、RET、ROS1）設(shè)計，對RNA文庫進行快速富集。羅氏診斷使用HyperPETE Lung Cancer Fusion Panel評估FASTASeq 300測序儀在融合檢出中的表現(xiàn)。測試結(jié)果下機數(shù)據(jù)質(zhì)量高，Raw data Q30>94%；捕獲效率>93%，僅需0.6G raw data（FASTASeq 300單次上機可完成12個樣本測試），即可將panel設(shè)計中覆蓋了任一partner的變異檢出。而且兩輪平行測試展示了FASTASeq300測序儀的臺間差小，表現(xiàn)穩(wěn)定。
注：粗體字為panel設(shè)計覆蓋的基因，非粗體不覆蓋。*為panel設(shè)計不覆蓋該融合位點相關(guān)基因。
實驗設(shè)計：以10ng 標(biāo)準(zhǔn)品Seraseq FFPE Fusion RNA作為投入，使用KAPA RNA HyperPrep Kit進行建庫，HyperPETE Lung cancer fusion panel進行雜交。雜交終文庫，在NovaSeq 6000和兩臺FASTASeq 300系列高通量基因測序儀上進行測序。分析參照羅氏白皮書——“SPR -White Paper- KAPA TE data evaluation for somatic mutations”。
本次測評使用羅氏診斷建庫試劑盒和靶向富集panel，完成了包括gDNA、FFPE DNA、cfDNA以及FFPE RNA樣本的測序，覆蓋了遺傳病和腫瘤NGS檢測的不同應(yīng)用場景。測評結(jié)果顯示，真邁生物測序平臺的性能表現(xiàn)已達到主流水平，適用的文庫類型和應(yīng)用場景多樣。
在高速發(fā)展的精準(zhǔn)醫(yī)療時代進程中，真邁生物將積極攜手羅氏診斷與其他合作伙伴，匯聚優(yōu)秀科技力量，推動NGS技術(shù)創(chuàng)新發(fā)展，賦能精準(zhǔn)醫(yī)療新未來。