CircRNA具有獨特的結構特性，相比線性mRNA更穩(wěn)定，抗降解，適合應用于癌癥免疫療法和疫苗開發(fā)等領域。在circRNA的合成過程中，會生成各種免疫原性副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物可以通過RNA感應途徑觸發(fā)免疫反應，影響circRNA的功能。當前的純化方法，如RNase R酶消化和尺寸排阻液相色譜(SEC)，在去除結構化或線性副產(chǎn)物方面效果不佳，導致免疫激活和蛋白質表達減少。因此，亟需一種優(yōu)化的純化策略，以高效去除激活免疫反應的副產(chǎn)物。

通過尺寸排阻色譜(SEC)分離未純化的編碼綠色熒光蛋白的環(huán)狀RNA (circ-eGFP)，得到3種不同組分：高分子量副產(chǎn)物組分(HMW)、主組分(circRNA、nicked RNA、線性RNA前體)和內含子片段組分。研究將不同分離組分或未純化的circRNA轉染到PMA分化的THP-1細胞中，然后進行轉錄組分析(SURFSeq 5000平臺)、RT-qPCR驗證及細胞因子檢測，結果發(fā)現(xiàn)：不同組分都能改變基因表達，特別是HMW組分誘導了強烈的免疫反應，未純化的circRNA及其組分顯著富集了與免疫反應相關的通路，激活了多種RNA傳感器，如TLR3/7/8、PKR、OAS、MDA5和RIG-I，導致細胞因子(如IFNβ、TNFα和IL6)和干擾素的產(chǎn)生?；赗T-qPCR分析，發(fā)現(xiàn)未純化的circ-eGFP和HMW組分誘導了最高水平的RNA傳感器和細胞因子表達，結果表明其具有較高的免疫原性。這些發(fā)現(xiàn)揭示了合成circRNA過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物對先天免疫系統(tǒng)的顯著激活作用，有效的純化策略就十分必要。

圖1 由I型內含子自剪接法合成的環(huán)狀RNA副產(chǎn)物激活先天免疫

研究人員鑒定了幾種關鍵的免疫原性副產(chǎn)物，包括位于HMW中的dsRNA、5'三磷酸內含子、主組分中的nicked RNA和線性RNA前體。聯(lián)合微晶纖維素(MCC)純化、RNase R酶和磷酸酶法逐步純化的circ-eGFP，免疫原性與SEC和酶處理常規(guī)法得到的超純circ-eGFP相當，都可以有效純化由I型內含子自剪接法合成的circRNA，有效減輕免疫反應。此外，木材衍生的多孔纖維素(WMC)也能高效去除不同長度的dsRNA，同時保持高回收率，適用于實驗室和工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)，且純化后circRNA在HeLa細胞和PBMCs中表現(xiàn)出高水平的蛋白表達，表明其在保持高純度的同時，也保持了良好的功能性和低免疫原性。轉錄組分析表明，純化后和未純化的circRNA在轉染細胞的基因表達與未處理對照組差異極小，進一步證實了其低免疫原性。

圖2 純化后的環(huán)狀RNA具有低的免疫原性

在細胞重編程過程中，即使是微量的雜質也可能顯著影響蛋白表達和細胞功能，因此生產(chǎn)高純度的circRNA對于高效的細胞重編程至關重要。研究人員使用來自轉錄因子OSKMLN的circRNA進行細胞重編程實驗，結果顯示，circRNA重編程的誘導多能干細胞(iPSCs)展現(xiàn)出與人類胚胎干細胞相似的全局基因表達模式，特別是關鍵多能性標記物的表達，表明成功抑制了體細胞轉錄程序并獲得了多能狀態(tài)。此外，轉錄組分析表明，circRNA重編程的iPSCs與人類胚胎干細胞在基因表達譜上高度一致，進一步驗證了其多能性。這一結果表明，高純度的circRNA能夠有效支持細胞重編程，為再生醫(yī)學和細胞治療提供了新的工具。

圖3 純化后的環(huán)狀RNA在細胞重編程上的功能驗證

Zhang Z,?Li W,?Ren X,?et al.?Mitigating Cellular Dysfunction Through Contaminant Reduction in Synthetic circRNA for High‐Efficiency mRNA‐Based Cell Reprogramming[J].?Advanced Science,?2025:?2416629.