近日，廣州國家實驗室范小英教授團隊在Cell Reports(IF 7.5)上發(fā)表了題為“Identification of the core regulatory program driving NEUROD1-induced neuronal reprogramming”的研究成果。研究人員建立了大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞體外重編程系統(tǒng)，通過單細胞與多組學測序技術(shù)(scRNA-seq、ATAC-seq、Cut&Tag和bulk RNA-seq)系統(tǒng)解析了轉(zhuǎn)錄因子NEUROD1(ND1)驅(qū)動星形膠質(zhì)細胞(Ast)向神經(jīng)元(Neu)轉(zhuǎn)分化的動態(tài)軌跡與分子機制。研究發(fā)現(xiàn)ND1作為先鋒因子通過誘導H3K27ac組蛋白修飾重塑染色質(zhì)開放性，激活包括Hes6在內(nèi)的25個關鍵調(diào)控靶點，其重編程過程高度模擬了體內(nèi)皮層神經(jīng)發(fā)生。這項研究不僅闡明了星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化過程中的獨特中間態(tài)細胞及核心調(diào)控網(wǎng)絡，更為神經(jīng)損傷修復和退行性疾病的治療提供了革命性策略。本研究采用真邁生物SURFSeq 5000平臺完成高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組測序分析。

成年哺乳動物大腦的神經(jīng)再生能力極為有限，僅在海馬齒狀回和側(cè)腦室下區(qū)等特定區(qū)域維持微弱再生能力，且新生神經(jīng)元數(shù)量極其有限。傳統(tǒng)外源細胞移植療法長期面臨細胞存活率低、功能整合差等瓶頸問題。在這一背景下，星形膠質(zhì)細胞展現(xiàn)出獨特的治療潛力。作為大腦內(nèi)數(shù)量最龐大的膠質(zhì)細胞群體，它們不僅分布廣泛，更在損傷后表現(xiàn)出類似神經(jīng)干細胞(NSCs)的再生特性。這些特性使其成為內(nèi)源性神經(jīng)再生的理想“細胞寶庫”。近年研究表明，通過特定干預手段可顯著提升膠質(zhì)細胞的神經(jīng)轉(zhuǎn)化效率，包括異位表達促神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄因子，如NEUROD1(ND1)；microRNA 干擾；PTBP1（一種重要的RNA結(jié)合蛋白）基因敲除；小分子化合物處理。作為神經(jīng)發(fā)育過程中的先鋒轉(zhuǎn)錄因子(TF)，ND1具有快速誘導神經(jīng)元表型的獨特能力，但其動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡仍待闡明。過往研究依賴于bulk RNA-seq，無法解析重編程過程中的細胞異質(zhì)性和多階段分子事件。本研究建立無內(nèi)源性神經(jīng)元干擾的體外ND1重編程系統(tǒng)，通過單細胞轉(zhuǎn)錄組(scRNA-seq)、染色質(zhì)可及性(ATAC-seq)和組蛋白修飾分析，揭示ND1驅(qū)動星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡，為理解神經(jīng)再生機制提供了新的理論框架。

為探究ND1誘導星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化(AtN)的細胞機制，研究團隊建立了體外轉(zhuǎn)分化研究體系。利用新生大鼠大腦皮層分離的原代星形膠質(zhì)細胞，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染實現(xiàn)ND1的穩(wěn)定過表達。研究結(jié)果顯示：在ND1過表達第三天時，經(jīng)典神經(jīng)元標志物TUJ1開始表達。隨后，通過對0-5天這一關鍵轉(zhuǎn)換期的scRNA-seq分析揭示了細胞命運決定的動態(tài)過程。完成數(shù)據(jù)過濾后，0天組捕獲了13,081個細胞，GFP對照組32,741個細胞，ND1過表達組46,164個細胞。研究者共鑒定出三種主要細胞類型：未成熟星形膠質(zhì)細胞(ImA)、成熟星形膠質(zhì)細胞(Astrocyte)和神經(jīng)元細胞(Neuron)。其中ImA可進一步分為三個亞群：增殖態(tài)ImA_div、靜息態(tài)ImA以及高表達ND1的ImA_ND1_hi，這些亞群均高表達Gfap與Tnc。Astrocyte也包含三個亞群：高表達Gfap/Tnc/Col11a1的Ast_1，以及高表達Atp1a2/Aqp4的Ast_2與Ast_3。神經(jīng)元分為4個亞群(Neu_1至Neu_4)，均高表達神經(jīng)元標志基因，且功能富集于軸突發(fā)生，樹突發(fā)育，神經(jīng)元遷移，以及細胞突起調(diào)控等神經(jīng)相關通路。隨著時間推移，細胞類型發(fā)生明顯變化：0天時，80%細胞為ImA，GFP對照組主要為ImA和Astrocyte，而ND1過表達組大部分細胞(52.5%)轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。第14天時，80%的GFP⁺星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)為TUJ1⁺神經(jīng)元，且超過90%為VGLUT1⁺興奮性神經(jīng)元，其中TBR1⁺與CTIP2⁺細胞占比較高。30天時，轉(zhuǎn)分化的神經(jīng)元已具備類似胚胎16.5天大鼠皮層神經(jīng)元的電生理特性，主要形成功能性興奮性神經(jīng)環(huán)路，其放電頻率與振幅與原代神經(jīng)元相當。這些結(jié)果證實了ND1能在大鼠星形膠質(zhì)細胞中實現(xiàn)快速高效的體外神經(jīng)元重編程，首次揭示了通過ImA_ND1_hi過渡態(tài)的轉(zhuǎn)分化軌跡，明確了神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化過程中的連續(xù)細胞狀態(tài)。

圖1?ND1誘導AtN過程中的細胞類型多樣性

通過整合多種ND1驅(qū)動的神經(jīng)元分化系統(tǒng)，研究者對ND1的ChIP-seq數(shù)據(jù)集進行了重新分析，并與本研究的AtN體系Cut&Tag數(shù)據(jù)進行了系統(tǒng)比較。研究團隊共鑒定出40個跨系統(tǒng)保守的ND1直接靶基因(包括已知的Hes6,?Mfap4,?Smad3等)，這些基因顯著富集于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關通路?；趕cRNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建的基因調(diào)控網(wǎng)絡，進一步將靶基因范圍縮小至25個與ND1表達密切相關的關鍵調(diào)控因子，其中20個基因顯著上調(diào)，證實ND1在AtN過程中主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用；同時發(fā)現(xiàn)5個下調(diào)的星形膠質(zhì)細胞相關基因，提示ND1還具有直接抑制膠質(zhì)細胞特性的功能。轉(zhuǎn)錄因子活性分析顯示，Hes6和Smad3在AtN過程中活性發(fā)生顯著改變，本研究新發(fā)現(xiàn)的靶點Meis2在轉(zhuǎn)化細胞中表現(xiàn)出顯著的TF活性增強。為驗證這些核心調(diào)控因子的功能，研究者通過shRNA對Hes6和Meis2進行了敲低，并結(jié)合真邁生物SURFSeq 5000平臺的bulk RNA-seq分析轉(zhuǎn)錄組水平的變化。Hes6敲低導致晚期神經(jīng)發(fā)生基因(如Tubb3、Slc1a、Slc17a7)顯著上調(diào)，同時伴隨TUJ1⁺/GFAP⁺雙陽性細胞比例增加，提示Hes6通過防止神經(jīng)元基因過早激活來確保轉(zhuǎn)分化的時序性。Meis2敲低顯著降低內(nèi)源ND1表達及其調(diào)控的神經(jīng)元發(fā)生基因，降低轉(zhuǎn)分化效率，表明Meis2通過維持ND1的表達從而驅(qū)動完整的神經(jīng)元重編程。這些發(fā)現(xiàn)不僅揭示了ND1通過共同的核心靶基因網(wǎng)絡調(diào)控神經(jīng)元分化的分子基礎，還闡明了Hes6和Meis2在AtN中的作用機制。

圖2?參與神經(jīng)元重編程的關鍵ND1靶點